Kit per PCR in tempo reale del virus del vaiolo delle scimmie

1. CampioneCollezione:I campioni devono essere raccolti in provette sterili in conformità

con specifiche tecniche standard.

2. Preparazione dei reagenti (area di preparazione dei reagenti)

Estrarre i componenti del kit, bilanciarli a temperatura ambiente per l'uso in standby.

3. Elaborazione dei campioni (area di elaborazione dei campioni)

3.1 Estrazione dell'acido nucleico

Si consiglia di prelevare 200μL di campioni liquidi, controllo positivo e controllo negativo per l'estrazione dell'acido nucleico, secondo i requisiti e le procedure corrispondenti dei kit di estrazione del DNA virale.

3.2 Dissoluzione della polvere liofilizzata e aggiunta del modello

Preparare la premiscela liofilizzata del virus del vaiolo delle scimmie in base al numero di campioni.Un campione necessita di una provetta PCR contenente polvere premiscelata liofilizzata.Il controllo negativo e il controllo positivo devono essere trattati come due campioni.

(1) Aggiungere 15μL di soluzione dissolvente in ciascuna provetta PCR contenente la premiscela liofilizzata, quindi aggiungere rispettivamente 5μL di campioni estratti/controllo negativo/controllo positivo in ciascuna provetta PCR.

(2) Coprire bene le provette PCR, muovere manualmente le provette PCR finché la polvere liofilizzata non è completamente dissolta e miscelata, raccogliere il liquido sul fondo delle provette PCR mediante centrifugazione istantanea a bassa velocità.

(3) Se si utilizza un comune strumento PCR in tempo reale per il rilevamento, trasferire direttamente le provette PCR nell'area di amplificazione;se si utilizza BTK-8 per il rilevamento, è necessario eseguire le seguenti operazioni: trasferire 10 μL di liquido dalla provetta PCR al pozzetto del chip di reazione di BTK-8.Una provetta PCR corrisponde a un pozzetto sul chip.Durante l'operazione di pipettaggio, assicurarsi che la pipetta sia verticale di 90 gradi.I puntali delle pipette con barriera aerosol devono essere posizionati al centro del pozzetto con forza moderata e smettere di spingere la pipetta quando raggiunge la prima marcia (per evitare bolle).Dopo aver riempito i pozzetti, estrarre la membrana del chip di reazione per coprire tutti i pozzetti e trasferire il chip nell'area di rilevamento dell'amplificazione.

4. Amplificazione PCR (area di rilevamento)

4.1 Mettere le provette per PCR/il chip di reazione nel serbatoio di reazione e impostare i nomi di ciascun pozzetto di reazione nell'ordine corrispondente.

4.2 Impostazioni di rilevamento della fluorescenza: (1) Virus del vaiolo delle scimmie (FAM);(2) Controllo interno (CY5).

4.3 Eseguire il seguente protocollo di ciclismo

Protocollo di ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:

 Protocollo BTK-8:

5. Analisi dei risultati (fare riferimento al manuale utente dello strumento）

Dopo la reazione, i risultati verranno salvati automaticamente.Fare clic su "Analizza" per analizzare e lo strumento interpreterà automaticamente i valori Ct di ciascun campione nella colonna dei risultati.I risultati dei controlli negativi e positivi devono essere conformi al seguente "6. Controllo di qualità".

6. Controllo di qualità

6.1 Controllo negativo: assenza di Ct o Ct>40 nel canale FAM, Ct≤40 nel canale CY5 con curva di amplificazione normale.

6.2 Controllo positivo: Ct≤35 nel canale FAM con curva di amplificazione normale, Ct≤40 nel canale CY5 con curva di amplificazione normale.

6.3 Il risultato è valido se tutti i criteri di cui sopra sono soddisfatti.In caso contrario, il risultato non è valido.

Interpretazione dei risultati

Sono possibili i seguenti risultati:

NOTA: Se si verificano risultati non validi, il campione deve essere raccolto e testato nuovamente.